怎样制备植物病毒接种物？
接种物的制备：制备接种物是把植物病毒从植株中抽取出来。一种是常规的抽取，就是将病组织捣碎，榨出液汁即可。另一种是将病组织中抽出的汁液继续加工提纯，成为粗提纯液，也就是去掉许多细胞中的非病毒部分。前法为：将一张新鲜的病叶片，约切取0.2g放在预先冷却的研钵中（也可不预冷，现常在研钵加液氮后研磨，兼有冷却和易粉碎的作用，使病毒更好从细胞析出），加缓冲液（也可只加数滴无菌水），然后研磨成糊。一般不稳定的病毒，以加pH＞7的缓冲液为宜，因pH高可以抑制核酸酶的作用。缓冲液种类则因各种病毒的反应而不同，有些病毒以用Tris或磷酸缓冲液为宜，而另一些需要硼酸缓冲液等。磷酸缓冲液的作用不仅是对病毒起作用，而主要的还是对接种植物使其易于感染。各种缓冲液的分子浓度也因不同病毒而异。为了消除核酸酶的作用，直接用酚来作抽提液则可以除去大量核酸酶，此外，为了保护接种物中病毒的RNA，用碱性缓冲液（pH9）及皂土（Bentonite）可以使核糖核酸的作用降到很低点。有时碱性氨基酸的聚合物也有保护作用。
花卉病毒类似病害的诊断和鉴定方法有哪些？
植原体、螺原体等无壁菌门的原核生物造成的植物病害与植物病毒产生的症状相似，无病症表现，因此，它们又叫病毒类似病害。花卉上比较常见的是植原体病害，因此我们介绍一下植原体病害的诊断和鉴定。
1 超薄切片，电镜下观察植原体
方法如植物病毒的超薄切片和电镜观察。
2 抗生素治疗诊断
用四环素、土霉素和金霉素等对受病植株进行叶面喷施和灌根，植原体对这几种抗生素敏感，病害症状可以得到缓解。而植物病毒对抗生素不敏感，如果施用，对病害无效。
3 植原体PCR检测
根据植原体的共同保守序列，用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到植原体的特异扩增带。
还可以将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到与引物设计相符的植原体的特异扩增带，说明为植原体病害。
这里以仙人掌植原体丛枝病的PCR检测为例，介绍植原体的PCR检测技术。
实验操作如下：
Ⅰ.总核酸提取
（1）取0.3g植株幼嫩组织，用液氮冷冻后充分研磨成粉状。
（2）移入含有0.6ml预热到60℃的CTAB DNA提取缓冲液中，在60℃水浴中温浴30min。
（3）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），抽提30min。
（4）12000r/min离心8min，取上清液，重复（3）、（4）步直至蛋白质除尽。
（5）加入氯仿∶异戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min离心8min，取上清液。
（6）加入等体积预冷的异丙醇及1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.2），混匀，-20℃保持至少30min，14000r/min离心10min，使核酸沉淀。
（7）用70%乙醇洗涤2次后，.真空干燥。
（8）沉淀溶解于100μl TE缓冲液中。
（9）取10μl DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，计算DNA浓度。其余于-20℃冰箱中保存备用。
Ⅱ.PCR扩增
参照Lee所报道的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：
R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′
R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′
R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′
R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′
引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μmol/L。
直接PCR（Direct-PCR）：
（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列试剂
10×PCR反应缓冲液 5μl
5mmol/L MgCl2 4μl
2.5mmol/L dNTP 4μl
R16mF2（或R16F2） 3μl
R16mRl（或R16R2） 3μl
4U/μl 1TaqDNA聚合酶 1μl
模板 2μl
加入双蒸水至终体积为50μl，混匀并加入30μl石蜡油。
（2）PCR扩增。反应循环为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存。
（3）取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。
巢式PCR（Nested-PCR）：
将用引物对R16mF2/R16mRl扩增的直接PCR产物按1∶40比例稀释后，作为反应模板，引物对换为R16F2/R16R2，退火温度升高至60℃，其余反应条件同直接PCR。
Ⅲ.结果
用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到一条约1.5kb的特异扩增带（图1）。通过实验，用泡桐丛枝作为植原体的阳性对照，检测出YNOl样品（仙人掌品种珊瑚枝丛枝）和YNO2（仙人掌品种堆罗汉丛枝）为植原体病害。其他YNO3（仙人掌品种猪耳掌丛枝）、YNO4（仙人掌品种金狮子丛枝病）、YNO5（仙人掌品种青海波丛枝）不是植原体病害，可能为品种的特性。
图1 直接PCR扩增结果
将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到一条约1.2kb的特异条带，与引物设计相符（图2），说明为植原体病害。直接PCR的检测灵敏度为10pg DNA，而巢式PCR可以提高检测灵敏度。使用直接PCR的检测得到比较模糊条带的，使用巢式PCR可以得到非常明显的条带。
图2 巢式PCR扩增结果
植物病毒重建实验是谁做的
植物病毒重建实验是Fraenkel-Conrat做的。
Fraenkel-Conrat在1956年用含RNA的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名的植物病毒重建实验，把TMV和 HRV的蛋白质外壳与RNA相分离，用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳，HRV的RNA与TMV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草，结论是RNA为病毒（烟草花叶病毒）的遗传物质。
人物简介：
弗伦克尔-康拉特（Fraenkel-Conrat) 德国-美国生物化学家。1910年7月29日生于德国布雷斯劳。 弗伦克尔-康拉特是一位著名妇科医生的儿子，1933年他在布雷斯劳大学获得医学学位。此后，随着希特勒的出现，他离开了德国。1936年他于爱丁堡大学获得生物化学方面的哲学博士，然后来到美国定居民。
1955年弗伦克尔-康拉特以噬菌体进行研究，发展了能将病毒的核酸和蛋白质分离而不会对核酸和蛋白质发生严重损害，而且分离后还可将它们再合在一起的技术。
至少有一些经过这样重新合在一起的病毒分子仍保留着它们的传染能力，因此，根据科学家据以判断病毒生命的很好判据来看，这些重新合在一起的病毒，仍如以前一样是存活的。这一成果加强了五十年代初期所积累起来的证据，即病毒是由一个空心的蛋白质外壳与壳内一个核酸分子组成的。
以上内容参考 百度百科-Fraenkel-Conrat
研究植物分子病毒要用到哪些东西
植物病毒是一类重要病害,几乎在各类作物上
都有发生,严重影响农作物的产量和质量,造成很大
的经济损失。由于大多数植物病毒病缺乏有效的防
治药剂,因此对病毒病害的控制主要通过采用无毒
种子和脱毒苗木和繁殖材料、清除感病植株及其传
毒介体以及植物检疫措施防止带毒材料的输入等方
法。如何对种子、苗木和无性繁殖材料以及在发病
早期对植株进行快速准确地检测就显得尤为重要。
而分子检测方法由于其相对于生物学、血清学、电镜
等检测技术更为快速、灵敏、准确的特点,越来越得
到广泛的应用,本文对植物病毒的分子检测方法的
研究进展进行了综述。
1 双链RNA(dsRNA) 技术
植物RNA 病毒、类病毒等在寄主体内形成ssR2
NA 的特异复制中间型,即dsRNA。而一般情况下,
植物体内不存在dsRNA ,因此,该技术可用于判断
RNA 病毒及类病毒是否存在,尤其适合于复合病毒
侵染的检测。目前,dsRNA 技术已用于隐蔽病毒组
(Cryptoviruses) 和呼肠孤病毒科(Reoviruses) 等19 个
病毒组的多种病毒的检测,对于一些潜隐病毒如草
莓轻型黄边病毒的检测也非常有效[1 ] 。此外,有的
病毒不同株系间存在不同的特征dsRNA 条带,而有
些多组分病毒也会产生具有一定差异的亚基因组
dsRNA ,利用植物病毒这些特性,dsRNA 技术可被应
用于黄瓜花叶病毒(CMV) 、柑橘衰退病毒(CTV) 和
烟草花叶病毒(TMV) 等病毒的株系分化及亚基因组
分析。植物感染病毒后产生相对稳定和高浓度的
dsRNA ,易于提纯,因而可以dsRNA 作模板对病毒核
酸序列进行研究。1995 年Karoses 等[2 ]利用dsRNA
作为中介,测定了柑桔速衰病毒完整的RNA 基因序
列。
2 核酸杂交技术
核酸杂交检测技术是根据互补的核苷酸单链可
以相互结合的原理,将一段病毒核酸单链以放射性
同位素或地高辛、生物素、荧光素等非放射性元素加
以标记,制成DNA 或RNA 探针,再与待测样品核酸
杂交,地高辛、生物素标记探针的杂交产物通过酶联
免疫吸附反应产生有色物质,而荧光素、光放射性元
素通过显影的方法产生杂交信号,从而指示病毒核
酸的存在。
核酸杂交技术操作简便、灵敏度高, 如Sek
Man[3 ]采用地高辛标记探针可分别检测出50pg 东亚
兰嵌纹病毒( CyMV) 和250pg 齿兰环斑病毒
(ORSV) 。而Pilar 等[4 ]采用地高辛标记探针检测天
竺葵花碎病毒(PFBV) ,天竺葵线条纹病毒(PLPV) 后
认为核酸杂交检测方法比ELISA 更灵敏,甚至可以
直接使用粗提液检测。以不同标记探针灵敏度比较
排序,放射性同位素 地高辛 生物素,但放射性同
位素存在放射性污染,而地高辛、生物素及荧光素则
相对更加安全。
3 多聚酶链式反应( PCR) 技术
3. 1 反转录PCR( PT2PCR) 技术
大多数植物病毒为RNA 病毒,因此要以RNA
为模板,在反转录酶的作用下逆转录生成cDNA 后,
再以cDNA 链为模板进行PCR 反应,这也是很常规
的两步法RT2PCR 技术。RT2PCR 技术检测灵敏度
非常高,Sanchez Navarro[5 ]采用RT2PCR 技术检测李
属坏死环斑病毒(PNRSV) 进行比较认为其灵敏度可
达fg 水平[8 ] 。随后,又发展了一步法RT2PCR 技术,
即反转录和PCR 在一个反应管中全部完成,从而大
大简化了RT2PCR 的操作步骤,并减少了整个PCR
操作过程中被污染的可能性。
3. 2 多重RT2PCR 技术
许多植物能够同时被多种病毒侵染,为了提高
病毒检测效率,人们又开发了多重RT2PCR 以及一
步法多重RT2PCR 检测方法,即在同一个反应中加
入所有待检病毒的特异性引物,从而可同时检测多
种病毒。如Tomohisa Kuroda[6 ]开发了可同时检测黄
瓜花叶病毒(CMV) 、蚕豆萎蔫病毒(BBWV22) 、三叶
草黄脉病毒(ClYVV) 的多重RT2PCR 技术, Takao
Ito[7 ]则开发了可检测柑橘裂皮类病毒(CEVd) 等6
种病毒的多重RT2PCR 技术。Sanchez Navarro[8 ]建立
了可检测苹果花叶病毒(ApMV) 等八种病毒的一步
法多重RT2PCR 技术。
3. 3 免疫捕获RT2PCR( IC2RT PCR)
预先用待检病毒的抗血清包被PCR 管,然后向
其中加入提纯的病毒或病毒提取液,通过包被在
PCR 管上的病毒特异性抗体吸附病毒粒体,然后加
入病毒裂解液破碎病毒颗粒释放出核酸分子,再进
行RT2PCR 扩增。由于免疫捕获过程中富集了病毒
粒体,并且排除了提取的总RNA 中杂蛋白、酚等物
质的干扰,所以其检测灵敏度比常规RT2PCR 技术
显著提高。M Hema[9 ]用IC2RT PCR 检测到了甘蔗线
条花叶病毒(SCSMV) 。
3. 4 实时荧光定量RT2PCR 技术
实时荧光RT2PCR ( Real2Time Fluorescent RT2
PCR) 检测技术的关键在于使用了特殊的探针,后被
称作分子信标(molecular beacon) 。该分子信标有一
茎环结构,环部序列与靶核昔酸序列欲扩增目的片
段中的一段保守序列互补,此保守序列处在PCR 两
个引物之间,分子信标两端序列与目的序列无关,是
彼此相互补的,其5’一端连有荧光的荧光报告子,
3’端连一无荧光的荧光粹灭子。在PCR 扩增前,没
有目的片段与分子信标杂交结合,分子信标是发夹
形的,荧光报告子和熄灭子是相互紧靠的,报告子中
的能量被转移到淬灭子上并以热能的形式释放出
来,因此不会发出荧光。当有目的序列存在时,分子
信标的坏部序列与目的序列结合,茎环打开,荧光报
告子与熄灭子分开,荧光不再被吸收而被释放出来,
随着PCR 扩增,目的序列增加,与之结合的分子信
标越多,发出的荧光量也相应增加。常规的RT2PCR
技术是对病毒进行定性鉴定,而将PCR 和荧光测定
相结合的实时荧光定量RT2PCR 不仅可避免假阳性
的出现, 还能进行实时定量检测,不需经琼脂糖凝
胶电泳就能观察产物, 而且提高了检测灵敏度。
Roberts 等用实时荧光定量RT2PCR 可检测少至50fg
的番茄斑萎病毒(TSWV) [10 ] 。
3. 5 竟争荧光RT2PCR 检测技术
对实时荧光定量RT2PCR 改进的竟争荧光RT2
PCR(CF2RT2PCR) 是将几组用不同的荧光素标记引
物加入同一个反应体系,这几组引物仅在3’端存在
差异,而其3’端则对应于不同病毒株系的多态性核
苷酸位点,只有3’端与目标片段完全互补的引物才
能引发扩增反应,释放出荧光,从而确定该引物已参
与扩增反应,这样就能把不同的病毒株系给区分开
来。这种检测技术可被用来比较病毒的株系差异及
进行多种病毒的检测[11 ] 。
3. 6 杂交诱捕反转录PCR 酶联免疫法(HC2
RT2PCR2ELISA)
该法利用共价结合在PCR 管壁上的寡核苷酸
进行特异性核酸诱捕, 然后以所诱捕到的核酸分子
作为模板进行RT2PCR 扩增,扩增后的液相产物可
以进行电泳检测,共价交联在管壁上的固相产物经
高温变性后,再加入互补的地高辛标记的杂交探针,
用碱性磷酸酯酶标记的抗地高辛抗体进行ELISA 检
测。该法去除了核酸粗提液中的杂质及聚合酶抑制
物,避免了RT2PCR 的漏检问题, 凝胶电泳检测液相
产物的同时对固相产物进行杂交检测、显色,有效避
免了假阳性现象。赵文军[12 ]用HC2RT2PCR - ELISA
检测番茄环斑病毒(ToRSV) 认为HC2RT2PCR2ELISA
比RT2PCR 灵敏度要高1 个数量级。
3. 7 简并引物PCR 技术( PCR with Degene
rate Primer)
该法根据血清学相关或同组的病毒分离物的基
因序列保守区设计简并引物,以此引物可以扩增出
所有同组或血清学相关病毒基因的特异性片段,然
后再通过RFLP 技术,将同组的病毒区分开。这样
就给对某些病毒组的鉴定和分子生物学结构的研究
提供了一种既快速、灵敏、又经济、方便的技术方法
和路线。如Letschert B 等[13 ] 用通用引物对血清学
相关的烟草花叶病毒组的多种病毒进行了鉴定。
3. 8 巢式PCR(Ne st PCR) 巢式PCR 是针对
那些引物特异性较差、非特异性带较多或者一轮
PCR 反应产物较少的病毒检测而设计,往往在第1
轮PCR 反应之后,再用*一次PCR 扩增目标基因片
段内部的另一对引物对PCR 产物进行第2 轮扩增。
这种方法已经被成功应用于侵染葡萄的凹陷病毒属
(Foveavirus) 和葡萄葡萄病毒属(Vitivirus) 的一些病
毒种的鉴定[14 ] 。此后人们又开发了IC2RT2PCR 与
巢式PCR 相结合的免疫捕获巢式PCR( IC2RT2PCR2
nested2PCR) 是将病毒免疫捕获后,用嵌套式的两对
引物进行PCR 反应,从而提高PCR 产量,提高检测
灵敏度。Helguera 等[15 ]应用此技术检测了桃树的桃
坏死环斑病毒( PNRSV) ,证实灵敏度比DAS2ELISA
高出3 个数量级。
3. 9 限制性片段长度多态性(RFLP)
其通过对病毒进行PCR 扩增后,再用各种酶对
PCR 产物进行酶切,根据酶切片段大小的变化,确定
病毒之间的差异。这种方法在分析同一种病毒的不
同分离物时可不经PCR 产物的回收及测序分析而
直接将不同的分离物区分开来。Wylie[16 ]就采用该
技术证明澳大利亚侵染羽扇豆的黄瓜花叶病毒只有
黄瓜花叶病毒亚组Ⅱ的一些株系。
4 核酸序列扩增检测技术
4. 1 常规核酸序列扩增法( nucleicacid se2
quence ba sed amplification ,NASBA)
核酸序列扩增法是一种以RNA 转录为基础的
等温扩增方法,适用于RNA(viralRNA ,mRNA ,rRNA)
分子的扩增。NASBA 扩增核酸使用寡聚核酸引物,
在AMV2RT , RnaseH ,T7 RNA 聚合酶协同作用下,形
成特定的反义单链RNA 的积累,通过杂交方法检测
产物。Klerk 等[17 ] 应用NASBA 技术可检测到10fg
提纯的马铃薯卷叶病毒( PLRV) 和马铃薯Y 病毒
(PVY) 。
4. 2 分子信标一核酸序列扩增法(Molecular
Beacon2NASBA)
该法也叫扩增RNA(AmpliDet RNA) 是以NASBA
为基础,在反应体系中引入如前面所述的实时荧光
RT2PCR 法中使用的分子信标做为PCR 合成产物的
指示分子,通过反应中荧光的有无判断检测结果,也
同样可以进行相对定量检测和多种病毒或病毒株系
的同时检测。Szemes 等[18 ]依据PVY不同株系序列
特异性设计了具有株系专化性的指示分子,采用此
技术实现了对PVY不同株系的鉴定。此后,又产生
了分子信标2NASBA 技术与免疫学技术相结合的IC2
Molecular Beacon2NASBA 技术,该技术是利用微量滴
定板中固定的病毒特异性抗体对病毒粒体进行免疫
捕获,以此部分纯化的病毒进行Molecular Beacon2
NASBA 扩增,对样品进行检测。Leone 等[19 ]利用此
技术PLRV 进行了检测,证明其效果与常规方法相
同。
5 基因芯片技术
基因芯片技术是很近国际上迅猛发展的一项高
新技术,是植物病毒快速检测技术的重要发展方向。
其原理是将各种病毒样品的基因片段或特征基因片
段点样,制成基因芯片,并以荧光标记的探针与芯片
进行杂交,杂交信号借助激光共聚焦显微扫描技术
进行实时、灵敏、准确的检测和分析,再经计算机进
行结果判断。该技术可同时检测植株中的多种病
毒,甚至可以区分不同的病毒株系,对于确定植株中
感染何种病毒尤其适合,相对于其他的分子检测技
术,其更加高效、准确、快捷。而目前尚未有商品化
的检测植物病毒的基因芯片,因此需单独制备每一
种病毒的基因检测芯片。Gung Pyo Lee 等[20 ]制备了
可检测黄瓜绿斑驳花叶病毒( CGMMV) 等四种烟草
花叶病毒组成员的cDNA 基因芯片。Ismail Abdullahi
等[21 ]应用该技术成功检测了马铃薯A 病毒( PVA)
等12 种病毒。
6 小结
我国植物病毒的分子检测技术不仅在科学研究
中被广泛应用,也已在各大口岸的植物病毒检验检
疫工作中得到了实际应用。随着经济的发展、科技
的进步,分子检测技术终将成为植物病毒学检测首
选方法。
所以你懂了，所需仪器复杂而多样，个人搞不到的，需要*援助和国际合作！！！
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